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按照以下内容绘制技术路线图，写中文\n3.1 拟采取的研究方案与实验方法\n本研究将遵循“临床现象验证—分子机制解析—细胞功能与微环境效应—体内模型确证”的逻辑路径，采用分子生物学、细胞生物学、免疫学及动物模型等多学科交叉手段展开研究。\n（一）临床样本分析：构建 NKILA/PMEPA1/自噬轴与 TIME 的临床关联图谱\n样本库构建与信息采集： 收集本中心病理科确诊的初治 DLBCL 冰冻及石蜡包埋组织样本（n=50），选取反应性淋巴结增生作为对照（n=10）。收集患者完整的临床病理资料（IPI 评分、COO 分型、LDH 水平等）及随访数据（OS, PFS）。\n分子表达检测：\nNKILA 检测： 提取组织总 RNA，采用 qRT-PCR 检测 NKILA 表达水平；应用RNA 原位杂交（RNA-ISH）技术在组织切片上直观定位 NKILA 的细胞来源（肿瘤细胞 vs 基质细胞）。\n甲基化检测： 提取组织 DNA，经重亚硫酸盐处理后，采用**甲基化特异性 PCR（MSP）**及亚硫酸氢盐测序 PCR（BSP）检测 NKILA 启动子区域甲基化状态。\nPMEPA1 及自噬分子检测： 采用 IHC 和 Western Blot 检测 PMEPA1、Beclin-1、LC3、p62 等蛋白表达。\nTIME 免疫表型分析：\n多重免疫组化/荧光（mIHC/IF）： 在同一张切片上标记 CD20（肿瘤 B 细胞）、CD8（细胞毒 T 细胞）、CD68/CD163（M2 型巨噬细胞）、PD-L1、MHC-I 等，利用数字病理扫描与图像分析系统，量化各免疫亚群的密度及空间分布关系。\n统计学分析： 分析 NKILA 甲基化/表达与 PMEPA1、自噬水平及 TIME 特征（如 CD8+ T 细胞浸润密度）的相关性；采用 Kaplan-Meier 和 Cox 回归模型评估该轴线对患者预后的预测价值。\n（二）分子机制解析：阐明 NKILA 转录后调控 PMEPA1 及自噬流的机理\n细胞模型构建： 选取 NKILA 低表达/启动子高甲基化的 DLBCL 细胞系（如 SU-DHL-6, OCI-LY3），利用 5-aza-dC 处理验证去甲基化效应。构建慢病毒稳转株：NKILA 过表达/敲低（shRNA/CRISPRi）、PMEPA1 过表达/敲除（CRISPR/Cas9），以及双基因干预模型（NKILA-KD + PMEPA1-OE）。\nNKILA 与 PMEPA1 mRNA 相互作用研究：\nRNA Pull-down： 设计生物素标记的 NKILA 全长及截短探针，孵育细胞裂解液，通过 qPCR 检测拉下的 PMEPA1 mRNA，并利用质谱鉴定共沉淀的 RNA 结合蛋白（RBPs）。\nRNA 免疫共沉淀（RIP）： 针对潜在的 RBPs（如 IGF2BP1, HuR 等）或 Ago2 进行 RIP 实验，验证 NKILA 是否作为支架招募 RBPs 或阻断 miRNA 结合。\nmRNA 稳定性实验： 在 NKILA 干预细胞中加入转录抑制剂放线菌素 D（Actinomycin D），在不同时间点检测 PMEPA1 mRNA 剩余量，计算半衰期。\n自噬流（Autophagic Flux）评价：\n双荧光报告系统： 转染 mCherry-GFP-LC3 质粒，通过共聚焦显微镜观察黄色斑点（自噬体）与红色斑点（自噬溶酶体）的比率，评估自噬流通畅度。\nWestern Blot 动态监测： 在有无溶酶体抑制剂（氯喹 CQ 或 Bafilomycin A1）存在下，检测 LC3-II 的转化及自噬底物 p62 的降解情况。\n（三）微环境重塑效应：解析自噬缺陷驱动免疫逃逸的三大路径\n路径一：抗原呈递与 T 细胞识别\nMHC-I 膜表达与转运： 利用流式细胞术检测细胞表面 MHC-I 分子密度；结合免疫荧光共聚焦，观察 MHC-I 与溶酶体（LAMP1）、自噬体（LC3）的共定位，评估胞内滞留/降解情况。\nT 细胞杀伤实验： 将经不同处理的 DLBCL 细胞与同种异体或抗原特异性 CD8+ T 细胞共培养，通过 LDH 释放实验或 Calcein-AM 释放实验检测 T 细胞杀伤效率；ELISA 检测上清中 IFN-γ、TNF-α 水平。\n路径二：PD-L1 稳态与免疫检查点\nPD-L1 降解途径分析： 使用蛋白质合成抑制剂（CHX）处理细胞，结合蛋白酶体抑制剂（MG132）或自噬/溶酶体抑制剂（CQ），通过 WB 确定 PD-L1 的主要降解途径。\nTGF-β/PMEPA1 信号互作： 利用 TGF-β1 刺激细胞，检测 SMAD2/3 磷酸化及 PD-L1 转录水平；验证 PMEPA1 缺失是否放大 TGF-β 对 PD-L1 的上调作用。\n路径三：TAM 极化与招募\n条件培养基（CM）与外泌体模型： 收集不同 NKILA/自噬状态 DLBCL 细胞的上清液，并提取外泌体。\n巨噬细胞极化实验： 将 CM 或外泌体加入 THP-1诱导的巨噬细胞或健康供者来源的 PBMC-Monocytes，通过流式细胞术（CD86 vs CD206/CD163）和 qPCR（iNOS, TNF-α vs Arg-1, IL-10）检测 M1/M2 极化表型。\n趋化与迁移实验： 利用 Transwell 小室评估 DLBCL 细胞对单核细胞的招募能力。\n（四）体内验证与干预：靶向 NKILA/自噬轴的治疗探索\n异种移植瘤模型（Xenograft）： 在 NOD/SCID 小鼠皮下接种稳定转染 NKILA/PMEPA1 基因的 DLBCL 细胞，监测肿瘤生长曲线。处死后行 IHC 检测 Ki67、Cleaved-Caspase3 及自噬标志物。\n人源化免疫重建小鼠模型（Humanized Mice）： 为验证免疫微环境改变，利用 NOG/NSG 小鼠移植人 PBMC 或 CD34+ 造血干细胞，重建人源免疫系统，随后接种 DLBCL 细胞。\n分组： 对照组、NKILA-KD 组、NKILA-OE 组、NKILA-KD + 自噬激活剂（如 Rapamycin）组、NKILA-KD + 5-aza-dC 组。\n检测指标： 监测肿瘤生长；流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中 CD8+ T 细胞的比例、耗竭标志物（PD-1, TIM-3）表达及 TAM 的 M2 极化比例。\n联合治疗探索： 评估去甲基化药物（5-aza-dC）联合 PD-L1 抗体在体内模型中的疗效，验证恢复 NKILA 是否能增敏免疫治疗。

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